倒置顯微鏡是一種結構型態(tài),相差顯微鏡是一種功能劃分,兩者無(wú)法直接對比。
倒置顯微鏡配備相差環(huán)板來(lái)實(shí)現相差
倒置生物顯微鏡通常屬于相差顯微鏡。倒置顯微鏡的透射光源在載物臺上,物鏡在載物臺下,故稱(chēng)“倒置顯微鏡”。倒置生物顯微鏡的透射光源和物鏡都是長(cháng)工作距離設計,通常會(huì )配備推拉式相差環(huán)板和相差物鏡,可實(shí)現相差觀(guān)察功能,以便觀(guān)察接近透明的未染色細胞等樣品。
正置也能實(shí)現相差(升級熒光和相差后的CX43)
正置顯微鏡也可以實(shí)現相襯觀(guān)察,只是相對少見(jiàn)。簡(jiǎn)易的正置相襯使用類(lèi)似倒置的推拉式相差環(huán)板,搭配帶插槽的聚光鏡,由于尺寸更小,精密度要求更高,而且可能還會(huì )有漏光等問(wèn)題,更可靠的設計是轉盤(pán)式切換的聚光鏡,這是很多正置顯微鏡實(shí)現相襯切換的思路。
相差可以觀(guān)察透明細胞樣本
相差顯微鏡指能進(jìn)行相差觀(guān)察的顯微鏡,相差觀(guān)察又稱(chēng)相襯觀(guān)察、澤尼克相襯法觀(guān)察,是一種利用相位差物理原理提升透明樣品對比度的技術(shù),主要用于未染色的細胞等樣品,這些樣品在明場(chǎng)下幾乎是透明的,難以看清,而染色則會(huì )影響其活性因而不適用,通過(guò)相差觀(guān)察,樣品物質(zhì)和厚度的差異將會(huì )轉化成對比度,從而揭示明場(chǎng)觀(guān)察無(wú)法看清的細節。
相差不適合看厚的和楔形的樣品,升級DIC解決
相差觀(guān)察的優(yōu)點(diǎn)很明顯,它可以不用染色就看清培養皿中的細胞和水中的微生物等樣品,十分方便且實(shí)現成本低,局限在于不適合厚度大的樣品,以及楔型結構的樣品,這些樣品可能需要用DIC微分干涉相襯或者HMC霍夫曼調制相襯來(lái)進(jìn)行觀(guān)察,前者具有非常好的立體感和的細節表現能力,但成本高,后者雖然會(huì )有色差問(wèn)題,但能以顯著(zhù)更低的成本實(shí)現類(lèi)似DIC的強立體感,適合批量部署,因此在IVF輔助生殖等領(lǐng)域會(huì )有應用。
除常規相差,還有特殊的負相差
相襯觀(guān)察還有正負和對比度高低之分,常見(jiàn)的相襯是正相襯,背景是亮色的,樣品被高亮光環(huán)包圍。而負相襯背景呈暗色,類(lèi)似暗場(chǎng),樣品主體會(huì )呈高亮。負相差物鏡有高對比(NH)和中對比度(NM)區別,會(huì )標記在物鏡上。
無(wú)限遠倒置熒光顯微鏡合成圖像
最后還有一點(diǎn)需要補充的是,固定筒長(cháng)顯微鏡和無(wú)限遠光學(xué)顯微鏡在相襯使用上的一個(gè)區別。在切換相襯和熒光觀(guān)察方式時(shí),需要把光學(xué)元件移入和移出光路,對于固定筒長(cháng)顯微鏡來(lái)說(shuō),額外的光學(xué)元件移入后,需要做補償以滿(mǎn)足固定筒長(cháng)需要,作為結果,不同觀(guān)察方式會(huì )有一定的成像倍率差異,視野不是一致的。
無(wú)限遠光學(xué)顯微鏡可以做到相襯成像視野和熒光成像視野一致,因此可以拍攝合成出有輪廓感/立體感的細胞熒光圖像。一般這需要先用平場(chǎng)消色差相襯物鏡拍攝相襯,然后切換到半復消色差物鏡拍攝熒光,以免損失熒光亮度,為了方便用戶(hù)進(jìn)行這種拍攝,明美還推出了半復消色差相襯物鏡,可以一個(gè)物鏡把相襯和熒光都拍好。